В статье описан процесс разработки способа одновременной генетической идентификации нуклеиновых кислот вирусов лейкоза (ВЛ) и иммунодефицита (ВИ) крупного рогатого скота (КРС). При создании данного способа были использованы ранее разработанные праймерные комбинации к провирусным ДНК ВЛ КРС, ВИ КРС и ДНК КРС. Для контроля амплификации были созданы два положительных контрольных образца (ПКО), представляющие собой рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pALT2 со встроенными специфичными нуклеотидными последовательностями участков провирусной ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС. Подобран оптимальный температурно-временной режим и экспериментально доказана его работоспособность. Методом десятикратных разведений рекомбинантных плазмид, несущих специфичные гены ВЛ КРС и ВИ КРС, определена минимальная чувствительность, которая составила 1–3 молекулы ДНК в 1 мкл реакционной смеси для генов обоих возбудителей. Также в результате проведения ПЦР с образцами гетерогенной и гомогенной ДНК доказана высокая специфичность разработанного способа. Практическая значимость и работоспособность разработанного способа подтверждены исследованиями образцов крови КРС, полученных от больных и здоровых животных из животноводческих хозяйств, не благополучных по лейкозу. Предложенный способ позволяет одной реакцией и в одной реакционной смеси обнаруживать и идентифицировать провирусную ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС одновременно.