По всем вопросам звоните:

+7 495 274-22-22

УДК: 619:616.98:578.828.11:636.22/.28

Одновременная идентификация возбудителей лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота

К. Усольцев канд. вет. наук, вед. науч. сотр., ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
М. Горбунова мл. науч. сотр., ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Р. Сафина аспирант, ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Р. Шангараев канд. вет. наук, мл. науч. сотр., ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Г. Сальманова аспирант, ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
К. Осянин канд. биол. наук, зав. отд., ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Т. Фаизов д-р вет. наук, зав. лаб., ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2
Н. Хаммадов канд. биол. наук, вед. науч. сотр., ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» 420075, Россия, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок, д. 2

В статье описан процесс разработки способа одновременной генетической идентификации нуклеиновых кислот вирусов лейкоза (ВЛ) и иммунодефицита (ВИ) крупного рогатого скота (КРС). При создании данного способа были использованы ранее разработанные праймерные комбинации к провирусным ДНК ВЛ КРС, ВИ КРС и ДНК КРС. Для контроля амплификации были созданы два положительных контрольных образца (ПКО), представляющие собой рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pALT2 со встроенными специфичными нуклеотидными последовательностями участков провирусной ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС. Подобран оптимальный температурно-временной режим и экспериментально доказана его работоспособность. Методом десятикратных разведений рекомбинантных плазмид, несущих специфичные гены ВЛ КРС и ВИ КРС, определена минимальная чувствительность, которая составила 1–3 молекулы ДНК в 1 мкл реакционной смеси для генов обоих возбудителей. Также в результате проведения ПЦР с образцами гетерогенной и гомогенной ДНК доказана высокая специфичность разработанного способа. Практическая значимость и работоспособность разработанного способа подтверждены исследованиями образцов крови КРС, полученных от больных и здоровых животных из животноводческих хозяйств, не благополучных по лейкозу. Предложенный способ позволяет одной реакцией и в одной реакционной смеси обнаруживать и идентифицировать провирусную ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС одновременно.

Литература:

1. Агольцов В. А. Сравнительная диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота / В. А. Агольцов, Е. С. Красникова и др. // Вестник Алтайского ГАУ. – 2012. – № 4 (90). – C. 56–59.

2. Апалькин В. А., Гулюкин М. И., Петров Н. И. Лейкоз КРС. – СПб.: Петролазер, 2005. – 105 с.

3. Байсеитов С. Т., Новикова Н. Н., Власенко В. С., Красиков А. П. Сравнительная оценка диагностической эффективности РИД, ИФА и РНИФ при лейкозе КРС. // Вест ник Омского государственного аграрного университета. – 2020. – № 1 (37). – С. 97–102.

4. Козырева Н. Г., Иванова Л. А., Степанова Т. В., Гулюкин М. И. Лабораторные испытания разработанной мультиплексной ПЦР-РВ при диагностике лейкоза крупного рогатого скота у молодняка // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. – 2019. – № 1 (29). – С. 56–62.

5. Красникова Е. С. Анализ аминокислотного состава молока коров, инфицированных ретровирусами / Е. С. Красникова, А. В. Банникова, А. В. Евтеев, Г. Х. Утанова // Актуальные проблемы ветеринарной хирургии, онкологии и терапии. – 2016. – С. 87–92.

6. Красникова Е. С. и др. Оценка качества молока, полученного от инфицированных ретровирусами коров, и определение способов его переработки // Научное обозрение. – 2015. – № 17. – С. 10–15.

7. Красникова Е. С. и др. Эпизоотическая ситуация по ретровирусным инфекциям животных в Саратовской области и оптимизация лабораторной диагностики // Современные технологии в ветеринарии зоотехнии. Творческое наследие В. К. Бирха: мат. Междунар. науч.-практич. конф. – Пермь, 2013. – С. 100–106.

8. Криворучко С. В. и др. Вирус иммунодефицита КРС в хозяйствах Ставропольского края // Ветеринарная патология. – 2012. – № 2 (40). – С. 35–38.

9. Никитин А. И., Усольцев К. В. и др. Способ экспресс-диагностики лейкоза КРС // Патент RU 2644233 C2, 08.02.2018. Заявка № 2016109396 от 15.03.2016.

10. Сафина Р. Ф. и др. Повышение чувствительности и специфичности ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС // Ветеринарный врач. – 2019. – № 2. – С. 8–14.

11. Сюрин В. Н., Самуйленко А Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Вирусные болезни животных. – М.: ВНИТИБП, 2001. – 446 c.

12. Усольцев К. В. Способ одновременной экспресс-диагностики лейкоза и вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота на основе метода мультиплексной ПЦР / К. В. Усольцев, Н. И. Хаммадов, К. А. Осянин, Т. Х. Фаизов // Физико-химическая биология как основа современной медицины: тез. докладов участ. Респуб. конф. с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения В. А. Бандарина. – Белорусский ГМУ, 2019. – С. 122–123.

13. Утанова Г. Х. и др. Молекулярно-генетическая диагностика вируса бычьего иммунодефицита // Сб. трудов IХ Всерос. науч.-практ. конф. с междун. участием «Молекулярная диагностика – 2017» / Под ред. академика РАН В. И. Покровского. – М., 2017. – Т. II. – С. 407–408.

14. Хаммадов Н. И. Генетические маркеры вируса ящура КРС, геномный анализ // Проблемы особо опасных инфекций. – 2019. – № 2. – С. 111–116.

15. Bazargani T. T. et al. The fi rst survey on the status of the bovine immunudefi ciency virus infection and associated clinical, pathological, haematological and fl ow cytometric fi ndings in holestein cattle in Iran // Journal of Veterinary Research. – 2010. – № 65. – P. 1–12.

16. Carpenter S. et al. Characterization of early pathogenic eff ects after experimental infection of calves with bovine immunodefi ciency-like virus // J. Virol. – 1992. – № 66. – P. 1074–1083.

17. Egberink H. Animal immunodefi ciency viruses / H. Egberink, M. C. Horzinek // Veterinary Microbiology. – 1992. – № 33. – P. 311–331.

18. González-Fernández V. D. et al. First evidence of bovine immunodefi ciency virus infection in Mexican // Transboundary and Emerging Diseases. – 2020.

19. Pablo-Maiso L. et al. Prospects in innate immune responses as potential control strategies against non-primate lentiviruses // Viruses. – 2018. – № 10 (8). – P. 435.

20. Snider T. G. et al. Natural and experimental bovine immunodefi ciency virus infection in cattle // Vet Clin North Am Food Anim Pract. – 1997. – № 13 (1). – P. 151–176.

21. Отчет по эпизоот. ситуации в РФ за 2019 г. // Офиц. сайт Россельхознадзора [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https:// fsvps.gov.ru/fsvps-docs/ru/iac/ rf/2019/ iac2019.pdf.

22. Вет. правила осущ. проф., диагн., огран. и иных меропр., устан. и отмены карантина и иных огран., напр. на предот. распрост. и ликвидацию очагов лейкоза КРС (Зарег. в Минюсте России 29.02.2021, рег. № 63300) [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://docs.cntd. ru/document/603433105? marker=6540IN.

23. Расчетные онлайн-формы для конверсии массы в моли // Интернет ресурс MolBiol.ru [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://molbiol.ru/scripts/01_07.html.

24. Таксономическая классификация NCBI: txid11646 [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi? mode=Info&id=11646&lvl=3&lin=f&keep= 1&srchmode=1&unlock.

25. Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://talk. ictvonline.org/taxonomy/.

26. Онлайн-утилита BLAST интернетресурса NCBI [Электронный ресурс]. — Режим доступа: https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome.

В Российской Федерации энзоотический лейкоз является наиболее распространенной инфекцией. Так, по данным Россельхознадзора, в 2019 г. энзоотический лейкоз занимал первое место по количеству заболевших животных (20 266 особей) [21]. Ущерб, причиняемый лейкозом КРС, обусловлен снижением продуктивности животных [5, 6], преждевременной выбраковкой больного лейкозом скота [2], уменьшением приплода и потерей его племенной ценности (ограничениями в реализации), переводом племенных животных в категорию товарных, затратами на проведение ветеринарносанитарных и зоотехнических мероприятий.

По существующим правилам борьбы с лейкозом КРС [20] основным методом, по которому определяют факт инфицированности животных возбудителем лейкоза КРС (ВЛ КРС), является реакция иммунодиффузии (РИД). Это достаточно простой и дешевый метод диагностики лейкоза, однако обладающий некоторыми недостатками, такими как субъективность, длительность постановки анализа (до 48 ч) и недостаточная чувствительность по сравнению с молекулярно-генетическими методами [1].

Согласно новым ветеринарным правилам по профилактике и ликвидации лейкоза [22], к узаконенным методам лабораторной диагностики добавился иммуноферментный анализ. Данный метод является более чувствительным и специфичным по сравнению с РИД, и он успешно адаптируется под различные автоматизированные системы проведения анализа, что значительно сокращает время постановки ИФА и снижает возможность ошибки исследователя. Однако следует понимать, что процесс антителообразования имеет волнообразный характер и зависит от возраста, физиологического состояния организма животного, условий кормления и других факторов [3]. Поэтому при лабораторной диагностике энзоотического лейкоза важно комбинировать серологические и молекулярно-генетические методы анализа, такие как ПЦР. ПЦР является высокочувствительным методом анализа и позволяет обнаруживать непосредственно провирусную ДНК возбудителя в исследуемой пробе. Данный метод позволяет выявлять возбудителя в организме уже на первых неделях жизни телят в отличие от серологической диагностики (РИД, ИФА), при которой устойчивые результаты анализов получаются к 6-месячному возрасту [4]. Кроме того, ПЦР позволяет надежно обнаруживать возбудителя лейкоза КРС в начале инкубационного периода, когда в крови животного ничтожный уровень специфических антител. Также метод ПЦР можно успешно адаптировать к автоматизированным системам проведения анализа, начиная с момента пробоподготовки и кончая детекцией результатов.

Для Цитирования:
К. Усольцев, М. Горбунова, Р. Сафина, Р. Шангараев, Г. Сальманова, К. Осянин, Т. Фаизов, Н. Хаммадов, Одновременная идентификация возбудителей лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота. Ветеринария сельскохозяйственных животных. 2022;1.
Полная версия статьи доступна подписчикам журнала
Язык статьи:
Действия с выбранными: