Современное состояние и клинико-биологические перспективы исследований по созданию жизнеспособных гамет из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

ВВЕДЕНИЕ

Проблема бесплодия, затрагивающая значительную часть мирового населения, в своих абсолютных формах, таких как аплазия герминативных клеток, преждевременная недостаточность яичников или ятрогенные повреждения вследствие терапии рака, остается неразрешимой с использованием стандартных методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [1]. Технология in vitro гаметогенеза (IVG) — процесс создания функциональных гамет (сперматозоидов и яйцеклеток) из соматических клеток пациента, предварительно репрограммированных в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), который представляет собой потенциально революционный подход репродуктивной медицины [2]. Теоретически, IVG позволяет получить неограниченный источник аутологичных гамет, что открывает перспективы для пациентов, утративших герминативные клетки. Особую актуальность это направление приобретает в контексте онкофертильности, предлагая гипотетическую, хотя и отдаленную, возможность восстановления фертильности у пациентов, прошедших гонадотоксичную химио- или лучевую терапию, особенно в препубертатном периоде, когда криоконсервация зрелых гамет невозможна [3].

Несмотря на значительный оптимизм, фундаментальная научная проблема заключается в рекапитуляции in vitro всего сложнейшего процесса гаметогенеза. In vivo этот процесс охватывает десятилетия (в случае оогенеза), включает точную спецификацию примордиальных герминативных клеток (PGC), их миграцию, сложное взаимодействие с соматическими клетками гонад, прохождение мейоза и два раунда тотального эпигенетического репрограммирования [2]. Хотя в моделях грызунов были достигнуты значительные успехи, включая рождение жизнеспособного потомства из ИПСК-производных гамет, трансляция этой технологии на человека сталкивается с фундаментальными препятствиями [4]. Эти барьеры ставят под серьезное сомнение безопасность, генетическую стабильность и функциональную жизнеспособность гамет, полученных in vitro [5].

Целью настоящей работы является проведение систематического анализа современного состояния и критическая оценка клинико-биологических барьеров и перспектив создания жизнеспособных гамет человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Систематизировать и проанализировать современные протоколы реконституции женской герминативной линии in vitro, сфокусировавшись на 3D-моделях и проблеме мейотического созревания.

Систематизировать и проанализировать прорывные подходы к реконституции мужской герминативной линии, включая ксенотрансплантацию, органоидные системы и методы прямой индукции мейоза.

Идентифицировать и критически оценить ключевые биологические барьеры, препятствующие получению функциональных гамет человека, включая мейотическую остановку, генетическую нестабильность и риски эпигенетической безопасности (в частности, нарушения геномного импринтинга).

Проанализировать трансляционные перспективы IVG (клинические и исследовательские) в контексте текущего этико-правового и регуляторного ландшафта.

Научная новизна работы заключается в оригинальном авторском синтезе, который не просто суммирует последние достижения, но и фокусируется на неразрывной связи между недавними прорывами в протоколах культивирования и фундаментальными, зачастую усугубляющимися, проблемами эпигенетической безопасности. В работе проводится критическая оценка адекватности текущих критериев безопасности («золотого стандарта») и анализируется, как новейшие протоколы (например, форсированная прямая индукция мейоза) могут создавать новые, еще не изученные эпигенетические риски, отодвигая клиническое применение технологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методологическая база настоящего исследования построена на принципах систематического обзора и сравнительного контент-анализа актуальной научной литературы. Для выявления общих тем, идентификации технологических прорывов, анализа существующих противоречий и определения нерешенных проблем в исследуемой области применялся качественный (нарративный) синтез данных.

Теоретической и эмпирической базой послужили научные публикации, проиндексированные в ведущих международных базах данных Scopus и Web of Science, а также данные, доступные через репозитории PubMed и MDPI. Поисковая стратегия охватывала период с 1 января 2015 г. по май 2025 г., что позволило обеспечить максимальную актуальность анализируемых данных. Поисковые запросы включали различные комбинации следующих ключевых терминов: «in vitro gametogenesis», «iPSC», «human induced pluripotent stem cells», «oogenesis», «spermatogenesis», «PGCLC», «epigenetic safety», «meiosis», «genomic imprinting», «artificial ovary», «reconstitution».

Критерии включения источников были следующими: 1) Публикации в рецензируемых научных журналах, преимущественно Q1 и Q2; 2) Период публикации; 3) Язык: английский; 4) Тематика: оригинальные исследования и обзорные статьи, посвященные протоколам дифференциации гамет человека и мыши из ИПСК, анализу безопасности (генетической и эпигенетической) и регуляторным аспектам IVG. Критериями исключения служили: 1) источники, не прошедшие рецензирование; 2) блоги, прессрелизы, новостные статьи и другие неакадемические ресурсы.

Для обработки данных применялся сравнительный анализ сопоставления эффективности, ограничений и рисков различных протоколов (например, оогенез и сперматогенез; in vivo ниша и in vitro органоид). Контент-анализ использовался для систематизации ключевых биологических и регуляторных барьеров. Авторский синтез применялся для формирования выводов о трансляционном разрыве между успехами в доклинических моделях грызунов и фундаментальными проблемами в исследованиях на клетках человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рекапитуляция оогенеза in vitro остаётся одной из самых трудных задач регенеративной медицины: в отличие от непрерывного сперматогенеза у взрослых, женский оогенез in vivo жёстко связан с формированием фолликула — трёхмерной структуры тесного паракринного взаимодействия ооцита с клетками гранулёзы и теки [6]. Стандартные 2D-культуры не поддерживают длительный рост фолликулов, поэтому развиваются 3D-системы, или «искусственные яичники» [7]. Современные протоколы создают овариальные органоиды путём агрегации PGCLCs из ИПСК с предшественниками соматического окружения, поскольку только 3D-структура обеспечивает нужную паракринную сигнализацию для инициации и поддержания фолликулогенеза [6, 8].

Ключевое ограничение — источник соматических клеток: наиболее успешные реконструированные яичники (xrOvary) ксеногенны и используют соматические клетки из эмбрионов мыши, что, несмотря на прогрессию мейоза в человеческих PGCLCs, непригодно для клиники и осложняет интерпретацию из‑за межвидовых различий в сигналах [9]. Хотя индуцирование FOSLCs из человеческих ИПСК активно развивается, их функциональная эквивалентность и способность поддерживать полный цикл фолликулогенеза in vitro не доказаны; неспособность воссоздать аутентичную соматическую нишу остаётся основной причиной сбоев созревания ооцитов [6, 9]. Кроме того, для созревания человеческих фолликулов требуется культивирование более 120 дней, что диктует необходимость динамических перфузионных систем: статические 3D-гели не обеспечивают достаточного снабжения питательными веществами [10].

Даже в наиболее продвинутых 3D-системах ооциты, полученные из ИПСК, демонстрируют феномен остановки созревания (maturation arrest). Они либо не возобновляют мейоз, либо останавливаются на стадии Metaphase I (MI), не достигая компетентной для оплодотворения стадии Metaphase II (MII) [11]. In vivo ооцит находится в аресте профазы I десятилетиями, поддерживаемый сигналами из фолликула. In vitro, при извлечении из фолликула, происходит спонтанное возобновление мейоза, но оно часто оказывается аномальным [12].

Это приводит к фундаментальной проблеме: асинхронности между ядерным созреванием (прогрессия мейоза) и цитоплазматическим созреванием (накопление мРНК, белков и митохондрий, необходимых для раннего эмбриогенеза) [13]. Для решения этой проблемы в клинической практике in vitro созревания (IVM) были разработаны продвинутые протоколы.

Новейшим подходом, иллюстрирующим эту проблему, является двухфазная (biphasic) IVM [14]. Этот протокол разделяет процесс на два этапа. В фазе 1 (Pre-IVM) ооциты культивируются в среде, имитирующей интрафолликулярное окружение и активно подавляющей мейоз ([например, с использованием ингибиторов фосфодиэстеразы 3A (PDE3A) или аналогов C-type natriuretic peptide (CNP)]). Это дает цитоплазме дополнительное время до 24 часов догнать ядро и завершить цитоплазматическое созревание. В фазе 2 (IVM) ооциты переносятся в стандартную среду IVM для индукции финального созревания до стадии MII.

Разработка таких сложных двухфазных протоколов является, по сути, признанием неудачи в создании полноценного искусственного яичника. Исследователи вынуждены применять фармакологические костыли для имитации тех сложных паракринных сигналов, которые в норме обеспечивает фолликулярная ниша [15]. Этот подход может решить тактическую задачу (получение MII-ооцитов), но он не решает стратегическую проблему аутентичности всего процесса гаметогенеза. Это оставляет открытым главный вопрос о долгосрочной компетенции и, что важнее, эпигенетической безопасности ооцитов, подтолкнутых к созреванию химическим путем.

В отличие от оогенеза, протоколы дифференциации ИПСК в сперматогониальные стволовые клетки (SSCs) in vitro являются относительно установленными [16]. Однако индукция полного цикла сперматогенеза, от SSC через мейоз к формированию гаплоидных сперматид, in vitro остается чрезвычайно сложной задачей [17].

Стандартным методом оценки герминативного потенциала ИПСК-производных клеток стала ксенотрансплантация. В рамках этого подхода (кейс-стади), герминативные клетки-предшественники, полученные из ИПСК человека, трансплантируются в семенные канальцы стерильных мышей-реципиентов [18]. В этой in vivo, хоть и чужеродной, нише, обеспечиваемой мышиными клетками Сертоли и Лейдига, клетки человека способны выживать, дифференцироваться, экспрессировать маркеры PGC (например, VASA) и корректно локализоваться у базальной мембраны канальцев, имитируя развитие in vivo. Этот метод успешно используется для валидации того, что клетки в принципе обладают герминативным потенциалом, и даже для изучения патогенеза бесплодия, например, у пациентов с AZF-делециями.

Однако ксенотрансплантация является методологическим черным ящиком [18]. Она подтверждает наличие потенциала, но не раскрывает механизмы, которые этот потенциал реализуют. В связи с этим, данный метод не может быть перенесен в клинику. Это доказывает, что соматическая ниша семенника предоставляет критические, но до сих пор не полностью идентифицированные факторы, которые пока невозможно адекватно воспроизвести in vitro.

Последние несколько лет ознаменовались появлением двух принципиально разных, конкурирующих подходов к преодолению барьера in vitro сперматогенеза.

Первый путем является био-реконституция. Недавние исследования сообщают о достижении полного процесса сперматогенеза in vitro с использованием 3D-систем органоидов семенника человека [19]. Утверждается, что в этих культурах, воссоздающих архитектуру семенных канальцев, наблюдаются все стадии: митотическое деление сперматогониев, мейоз сперматоцитов и спермиогенез с формированием морфологически корректных гаплоидных сперматид. Критически важным заявлением в этой работе является то, что полученные сперматиды обладают нормальным статусом метилирования импринтированных генов. Если это подтвердится, это станет огромным шагом к решению проблемы эпигенетической безопасности.

Вторым путем является молекулярная инженерия. Почти одновременно была предложена радикально иная методология: прямая индукция мейоза из ИПСК, полностью минуя стадию PGC и длительное культивирование [20]. Этот 15‑дневный протокол использует агрессивный набор из химических соединений и факторов транскрипции. Ключевые компоненты включают: 1) Ингибитор DNMT1 (для принудительного и быстрого стирания метилирования ДНК) и 2) Оверэкспрессию про-мейотических (например, HOXB5, BOLL) и антиапоптотических (BCL2) факторов. В результате, по сообщениям, клетки входят в мейоз, формируя синаптонемные комплексы и достигая стадий лептотены/зиготены.

В настоящее время наблюдается два расходящихся пути к мужскому IVG. Био-реконституция пытается медленно и точно воссоздать естественный процесс в органоиде, что теоретически обещает большую эпигенетическую безопасность за счет прохождения клетками естественных чекпоинтов [19]. Молекулярная инженерия быстра, эффективна, но несет колоссальные, неизученные эпигенетические риски [20]. Принудительное стирание метилирования с помощью ингибитора DNMT1 является грубой силой, которая может быть неполной, неточной и катастрофической для деликатных паттернов геномного импринтинга.

Для систематизации представленных данных, в табл. 1 приводится сравнительный анализ современных подходов к IVG.

Оогенез из ИПСК в овариальном органоиде с индукцией PGCLC (BMP4, WNT) и соматической поддержкой требует длительных протоколов (>120 д) и часто завершается MII-блоком из‑за рассинхронизации цитоплазмы и ядра; валидация — двухфазный IVM и морфология. Тестикулярный органоид (путь 1) при участии соматических клеток даёт гаплоидные сперматиды за недели — месяцы, но ограничен низкой эффективностью и сомнительной функциональностью (валидация: импринтинг, ксенотрансплантация). Прямая индукция (путь 2) в 2D / 3D быстрый (~15 д), использует ингибиторы DNMT1 и оверэкспрессию BCL2/HOXB5/BOLL, приводит к мейотическим клеткам (лептотена / зиготена), но остаётся проблема завершения мейоза и эпигенетической аутентичности (валидация: маркеры синаптонемного комплекса). На рис. 1 представлена схема новейшего протокола прямой индукции мейоза.

Рис. 1. Схема протокола прямой индукции мейоза из ИПСК. Fig. 1. Schematic diagram of the direct meiosis induction protocol from iPSCs.

Клиническая трансляция IVG упирается в небольшие, статистически фиксируемые риски эпигенетических изменений, унаследованные от ИПСК, прежде всего в эпигенетическую безопасность [21]. Репрограммирование соматической клетки в ИПСК и её дифференциация в гамету должны корректно повторить два крупномасштабных события: полное стирание соматической эпигенетической памяти и стирание родительского импринтинга с его восстановлением по полу гаметы.

Выделяются два основных сбоя. Первый — неполное репрограммирование: ИПСК нередко сохраняют эпигенетическую память исходных клеток, что искажает дифференцировку герминативной линии и ведёт к аберрантной экспрессии генов [22]. Второй — нарушения импринтинга: критические локусы (например, H19, IGF2) часто имеют аномальные и нестабильные паттерны метилирования в ИПСК-производных клетках, а использование гамет с такими дефектами несёт прямой риск тяжёлых нарушений развития у потомства [23, 24].

На этом фоне формируется запрос на «золотой стандарт» эпигенетической безопасности до любых клинических испытаний: мультиомное сходство с естественными гаметами (транскриптом, полным метиломом, профили гистоновых модификаций), демонстрация безопасности и фертильности на нескольких поколениях животных, а также морфологически и мультиомно нормальное развитие человеческих эмбрионов in vitro до 14 дней [25]. Возникает трансляционный парадокс: чтобы доказать безопасность IVG-гамет, нужно создавать человеческие эмбрионы и проводить их всесторонний, включая деструктивный, анализ, тогда как актуальные руководства (например, ISSCR) и законы большинства стран (например, ЕС) это запрещают, даже в исследовательских целях [26]. На рис. 2 показаны основные барьеры эпигенетической безопасности в IVG.

Рис. 2. Основные барьеры эпигенетической безопасности в IVG. Fig. 2. Key barriers to epigenetic safety in IVG

Таким образом, путь к необходимой валидации технологии заблокирован этическими ограничениями, которые эта же технология и порождает.

ИПСК по природе генетически нестабильны: репрограммирование может индуцировать мутации [24], а длительное культивирование, необходимое для многомесячных протоколов IVG, ведёт к селекции клеток с хромосомными аномалиями и ростовым преимуществом [27]. В линиях ИПСК и ЭСК человека регулярно выявляют рекуррентные нарушения — анеуплоидии (часто трисомии 12 и 17) [27, 28] и вариации числа копий (CNVs), которые накапливаются с временем культивирования [24].

Хотя крупные анеуплоидии теоретически могут быть отсеяны на этапе ПГТ-А, остаётся скрытая угроза: точечные мутации и CNVs в ИПСК-гаметах могут ускользать от стандартного скрининга [24, 27]. В отличие от in vivo, где действуют строгие механизмы контроля качества (например, апоптоз дефектных герминативных клеток), условия in vitro могут способствовать выживанию генетически аномальных гамет; более того, ряд новых протоколов (например, прямая индукция мейоза) сознательно используют антиапоптотические факторы (BCL2) для повышения эффективности [20]. В результате возникает риск получения гамет с de novo мутациями и их передачи потомству.

Перспективы IVG целесообразно рассматривать в двух горизонтах и для двух применений. Долгосрочная клиническая цель, лечение бесплодия, по оценке большинства экспертов остаётся делом отдалённого будущего, вероятно, на десятилетия [5]. Наиболее этически оправданный и востребованный сценарий– онкофертильность: для пациентов, особенно препубертатных, проходящих гонадотоксичную терапию, криоконсервация гонадной ткани с последующим репрограммированием соматических клеток в ИПСК может стать единственным шансом на генетически родное потомство.

Краткосрочно IVG уже служит незаменимой исследовательской платформой [29], позволяя моделировать ранний гаметогенез, миграцию PGC, молекулярные механизмы мейоза, причины генетически обусловленного бесплодия (например, остановку созревания ооцитов) и механизмы установления/стирания импринтинга. Тогда как общественная дискуссия почти полностью сосредоточена на «создании детей» [30], реальная научная ценность в ближайшие десятилетия — в использовании IVG как инструмента фундаментальной биологии [31]. Этот разрыв порождает завышенные ожидания и осложняет взвешенные этические и регуляторные дебаты.

Регуляторная среда неоднородна, фрагментирована и в целом запретительна [32]. ЕС демонстрирует наиболее строгий подход: «Закон о защите эмбрионов» в Германии прямо запрещает модификации герминативной линии, а «Конвенция Овьедо» накладывает жёсткие ограничения; возможна правовая квалификация ИПСК-гамет как ATMP с необходимостью прохождения процедур CTR.

В США действует «лакунарный» подход: прямых федеральных запретов на исследования нет, но FDA блокирует федеральное финансирование и одобрение клинических испытаний, связанных с редактированием герминативной линии или созданием эмбрионов из искусственно полученных гамет. В Японии регулирование мягче для исследований: руководства MLHW допускают редактирование герминативной линии в исследовательских целях, строго запрещая репродуктивное применение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный систематический анализ современного состояния исследований по созданию гамет из ИПСК позволяет сформулировать следующие ключевые выводы.

У грызунов IVG уже доказана (вплоть до рождения фертильного потомства, включая однополых), тогда как у человека исследования лишь переходят от стабильной индукции PGCLC к первым попыткам полного гаметогенеза in vitro — через 3D-органы или прямую индукцию мейоза. Трансляцию на человека тормозят два связных барьера: биологический — невозможность полноценно воссоздать соматическую нишу (дефекты сигнализации, асинхронность, сбои мейоза, остановка созревания), и безопасностный — высокий, плохо контролируемый риск генетической и особенно эпигенетической нестабильности, усиливаемый длительным культивированием.

Таким образом, поставленные в работе цели достигнуты. Показано, что, несмотря на медийный и общественный фокус на репродуктивном потенциале IVG, практическая значимость технологии в обозримом будущем (10–20 лет) заключается не в клиническом применении, а в ее использовании как уникальной исследовательской платформы. IVG позволяет моделировать in vitro те аспекты раннего гаметогенеза, мейоза, геномного импринтинга и патогенеза бесплодия, которые невозможно изучать на человеке in vivo. Безопасное клиническое применение, если оно когда‑либо станет возможным, потребует не только революционных технологических прорывов в культивировании, но и разработки неинвазивных методов оценки «золотого стандарта» эпигенетической безопасности и фундаментального пересмотра текущих регуляторных и этических парадигм.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов при написании статьи.

The authors declare no conflict of interest involved in preparation of the article.