Актуальность темы. Одной из основных пород свиней, разводимых в Республике Беларусь, является порода йоркшир. В последние годы генофонд этой породы активно обогащается за счет импорта племенного материала из других стран. Как правило, чтобы завезенное племенное животное считать действительно племенным и возможным использовать его в селекционной работе, на него и его родителей, согласно действующему законодательству (в разрезе как минимум трех поколений родословной), должен быть помимо племенного свидетельства заведен генетический сертификат с генетическим профилем, куда вносятся данные по результатам исследований STR-анализа. В нем содержится панель микросателлитов, которую необходимо полностью расшифровать и позже использовать при формировании базы генетических ресурсов (различных пород) и других референтных баз. Хотя и этого недостаточно для идеального определения «чистоты» происхождения [7, 8].
Ведущими племенными предприятиями, занимающимися разведением породы йоркшир, являются ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» Минской и ОАО «СГЦ «Западный» Брестской областей. Основу стад вышеназванных хозяйств составляют животные, завезенные из-за рубежа, прошедшие акклиматизацию и адаптацию. Учитывая масштабы влияния животных породы йоркшир на состояние отрасли свиноводства в стране, дальнейшая интенсификация племенной работы с популяциями животных белорусского заводского типа свиней обусловливает необходимость проведения анализа генетических структур для разработки программ внутрипородной селекции и контроля чистопородности племенных животных [1, 2, 4].
Дальнейшая интенсификация племенной работы с популяциями животных белорусского заводского типа свиней породы йоркшир обусловливает необходимость анализа генетических структур, объединение животных различных линий на основе популяционно-генетических методов для разработки программ внутрипородной селекции и контроля чистопородности племенных животных. Исследования в данном направлении были проведены в рамках ГНТП «Агропромкомплекс – 2020» (задание 3.10.4 «Создать племенные стада на основе новых заводских линий в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир с использованием ДНКтестирования и микросателлитных маркеров»).
Важным инструментом в данной работе является применение ДНК-тестирования и анализ установленных микросателлитных локусов. Микросателлитные локусы – это короткие (до 10 п.н.), последовательно расположенные нуклеотидные повторы ДНК, которые являются удобными генетическими маркерами благодаря относительно несложной методике определения высокого уровня полиморфизма и стабильного аутосомного кодоминантного наследования [3, 5, 6, 9].
Высокая информативность микросателлитов делает их удобным инструментом для решения практических задач, таких как установление отцовства и материнства, а также анализ генетических взаимоотношений между популяциями. При решении такого рода вопросов достоверность выводов зависит от информативности исследованных полиморфных локусов, которую можно оценить на основании данных частоты аллелей и дисперсии микросателлитных повторов. В последние годы появилось много сообщений о возможной связи между определенными аллелями (или генотипами) для ДНК–МС и продуктивными качествами животных [11–16, 18].
Так, была отмечена связь полиморфизма МС-ДНК с удоем и показателями качества молока у коров, с живой массой и яичной продуктивностью у кур, с уровнем развития репродуктивных качеств у овец и коз. Для дикого кабана была обнаружена аллель-специфичная ассоциация ДНК–МС с вероятностью развития туберкулезной инфекции [17].
Исследования также направлены на анализ ассоциации между маркерами STR-локусов и воспроизводительными качествами свиноматок. Научные опыты ученых Украины и России позволили определить связь между генотипами локусов. Более высоким многоплодием характеризовались свиноматки, имеющие в генотипе аллели SW 24109, SW 24113, SW 72103. Аллель в локусе S0 386178 была маркером повышения общего количества поросят при рождении. Закономерности, выявленные в этом пилотном эксперименте, показали необходимость более углубленного изучения данного вопроса, что позволит вывести селекционный процесс на качественно новый уровень [10].
Основным ограничением широкого практического применения ДНК–МС в качестве генетических маркеров является высокая стоимость исследований. Принимая во внимание большое значение достоверности происхождения племенных животных, МСХиП Республики Беларусь ввело генетическую экспертизу происхождения племенного молодняка в качестве одного из обязательных требований для аккредитации племенных заводов, генофондных хозяйств и селекционно-гибридных центров. Данная работа начата с января 2020 г. в рамках Подпрограммы «Развитие племенного дела в животноводстве» Государственной программы развития аграрного бизнеса в Республике Беларусь на 2019–2020 гг. и продолжается в 2021–2025 гг. Кроме того, ремонтных хрячков отцовских пород дополнительно исследуют на гены-маркеры, отвечающие за мясную продуктивность, а ремонтных хрячков материнских пород – на гены-маркеры, определяющие воспроизводительные качества.
Цель исследований – изучение линейной структуры белорусского заводского типа свиней породы йоркшир на основе анализа дифференциации ДНКмикросателлитов.
Материал и методы исследований. Научно-исследовательская работа по созданию племенных стад в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир на основе новых линий и для определения линейной принадлежности хряков с использованием ДНКтестирования и микросателлитного анализа проводилась в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» Минской и ОАО «СГЦ “Западный”» Брестской областей. В селекционной работе использовались чистопородные хряки породы йоркшир. Исследования в области генетики выполнялись в лаборатории молекулярной биотехнологии и ДНК-тестирования РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству» и лабораторных условиях ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства – ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста».
У исследуемых животных взяты биопробы ткани уха, из которых была выделена ДНК. Генотипирование свиней проводили методом ПЦР-ПДРФ. Выделение ДНК осуществляли с помощью колонок Nexttec (Nexttec™ Biotechnologie GmbH, Германия) согласно протоколу фирмы-изготовителя. Обработку данных капиллярного электрофореза осуществляли путем перевода длин фрагментов в числовое выражение на основании сравнения их подвижности со стандартом ДНК по 9 и 12 STR-локусам (S0 155, S0 355, S0 386, SO 005, SW 72, SW 951, S0 101, SW 240, SW 857, SW 911, SW 936, S0 227, S0 90).
Биометрическую обработку материалов исследований проводили методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием пакета программы Microsoft Excel с плагином GenAIEx v. 6.5. Для оценки индивидуальной, внутри- и межпопуляционной изменчивости проводили анализ AMOVA (анализ молекулярной вариансы). Обработку данных, полученных при изучении переноса генов, эффективного размера популяций, миграционных процессов, внутривидового распределения генетической изменчивости и степени дифференциации популяций осуществляли по Б. Вейру. Изменчивость микросателлитов в изучаемых популяциях свиней оценивали по значениям индекса фиксации Fst и Rst.
Результаты исследований и их обсуждение. В результате анализа генетического разнообразия исследуемых новых линий в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир установлено, что наблюдаемая степень гетерозиготности в исследуемых линиях СГЦ «Западный» находилась в пределах от 0,500 до 0,704 у животных линии Фактор 1573 и Дюшес 3962 (табл. 1).
Ожидаемая гетерозиготность (Нe), или генное разнообразие – это вероятная ожидаемость того, что особь будет гетерозиготна по соответствующему локусу в мультилокусных системах (для всех анализируемых локусов). Но степень наблюдаемой гетерозиготности является мерой генетической изменчивости популяции. Значение для Нe и Но варьирует от 0 (нет гетерозиготности) до 1 (больше аллелей с равной частотой встречаемости). Ожидаемую гетерозиготность обычно определяют, когда описывают генетическое разнообразие, поскольку она менее чувствительна к размеру выборки, чем наблюдаемая гетерозиготность (Но). Если (Но) и (Нe) схожи, то спаривание в популяции происходит случайно, при Но<Не – популяция инбредная. Если Но>Не, то случайное спаривание преобладает над инбридингом. Если наблюдается низкая гетерозиготность (<0,5), стадо инбредное и однородное. Гетерозиготность ближе к 0,5 характеризует низкую инбредность.
Индекс фиксации (Fis) количественно отражает отклонение частот встречаемости гетерозиготных генотипов и может рассматриваться как критерий инбредности популяции. Положительное значение индекса Fis означает нехватку гетерозигот в популяции, отрицательное значение – их избыток.
Следует отметить, что животные линии Друг 6805 характеризовались максимальным значением ожидаемой гетерозиготности (He=0,686±0,030), в то время как животные, принадлежащие к линии Фактор 1573, имели минимальные значения показателя (He=0,333±0,088). Величины наблюдаемой гетерозиготности были выше, чем ожидаемой, что указывает на высокий уровень «чистоты» генеалогической и генетической оригинальности линий исследованных животных в популяции белорусского заводского типа свиней породы йоркшир. На основании полученных результатов выявлен высокий уровень наблюдаемой гетерозиготности, который подтвердился отрицательными значениями индекса фиксации (Fis), а это значит, что животные различных линий характеризовались смещением генетического разнообразия в сторону небольшого избытка гетерозигот. Наибольшей величиной значения отрицательного индекса фиксации (Fis) отличались животных линии Фактор (–0,511±0,153), а наименьшей – животные линии Друг (–0,026±0,041).
Наблюдаемый уровень гетерозиготности (Но) среди животных изучаемых линий ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» находился в пределах от 58,3 до 69,0 %. Это свидетельствует о достаточном генетическом разнообразии особей данной популяции. Вместе с тем, достаточно высокий уровень наблюдаемой гетерозиготности в ряде линий не привел к избытку гетерозигот. Был установлен дефицит гетерозигот, в частности в линиях Добрый 2313 и № 1131, что проявляется в положительных значениях индекса фиксации (Fis=0,125–0,198). Степень гетерозиготности, рассчитанная по 12 локусам ДНК–МС, показала, что в двух исследуемых линиях отмечен недостаток гетерозигот – 12,5–19,8 %, при этом наименьшим дефицитом характеризовались животные линии Друг 6805 (6,5 %). Хряки данной линии отличались наибольшими значениями ожидаемого гетерозиса (He=0,518±0,061).
В результате анализа и оценки молекулярной вариации (генетической изменчивости популяции хряков в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир из СГЦ «Западный») установлено, что 98,0 % генетической изменчивости линий в белорусском заводском типе породы йоркшир приходилось на изменчивость внутри изученных линий и 2 % – на изменчивость между линиями (р < 0,001) (рис. 1).
Рис. 1. Структура генетической изменчивости линий белорусского заводского типа свиней породы йоркшир
На основании показателей молекулярной изменчивости различных линий в белорусском заводском типе породы йоркшир, разводимых в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита», установлено, что 93 % генетической изменчивости приходилось на внутрилинейную и 7 % – на изменчивость между линиями.
Характер селекционной работы на генетическом уровне указывает на повышение продуктивных качеств и консолидацию признаков в популяции свиней различных линий (табл. 2).
Результаты анализа молекулярной вариансы (R-статистики) свидетельствуют о том, что 4,5 % общей генетической изменчивости, отмеченной среди линий исследованных животных, определяется принадлежностью их к племенному стаду племпредприятия «Западный».
При проведении подборов оценивали генетическое сходство родителей по показателю Rst, рассчитанному с использованием функции AMOVA (меньшее значение Rst указывает на большее генетическое сходство родителей). Оценка молекулярной вариансы свидетельствует о том, что на 0,55 микросателлитной изменчивости свиней различных линий обусловлена уникальностью животных, входящих в стадо белорусского заводского типа породы йоркшир из ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита».
Результат анализа микросателлитной изменчивости племенных хряков, входящих в отдельные стада, составляющие белорусский заводской тип породы йоркшир, позволяет определить долю влияния на их чистопородность основных критериев – популяции (селекционного стада), отбора и подбора родительских пар (селекции в стаде), генотипа самого животного. Высокая доля микросателлитной изменчивости племенных животных (86 %) указывает на их принадлежность к различным линиям различной генетической структуры в белорусском заводском типе породы йоркшир.
Линейные генетические особенности позволяют поддерживать генеалогическую структуру белорусского заводского типа и являются возможностями для его совершенствования. Основу микросателлитной изменчивости составляют различия между животными – 13 %, в пределах линии – 86 %, которые представляют популяцию «СГЦ «Западный» (рис. 2).
Рис. 2. Структура микросателлитной изменчивости
Оценка микросателлитной изменчивости племенных животных, входящих в различные линии, формирующие стадо белорусского заводского типа породы йоркшир, разводимой в «ЖодиноАгроПлемЭлита», позволяет определить долю влияния животных различных линий в популяции и вести отбор и подбор родительских пар с учетом индивидуальных особенностей. Высокая доля микросателлитной изменчивости племенных животных в линиях (97 %) указывает на их принадлежность к различным линиям.
Степень генетической дифференциации линий оценивали на основании попарных значений Fst. Значение показателя Fst показывает, что различия в соотношении частот локусов ДНК–МС между исследуемыми линиями в ОАО «СГЦ “Западный”» на 4,2 % обусловлены особенностями линий (табл. 3).
В результате оценки F-статистики в целом отмечено, что Fis и Fit имеют положительные значения, что указывает на снижение гетерозиготности индивидуумов в каждой из популяций вследствие заказных спариваний. Результаты анализа молекулярной вариансы (AMOVA) свидетельствуют о том, что 3,4 % общей генетической изменчивости, а в разрезе локусов их частота составляет 4,0 %. Это обусловлено особенностями линий, разводимых в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита».
Основная доля аллельной изменчивости приходится на индивидуальные особенности самих животных, что обусловлено их генотипами и спецификой использования в племенном предприятии. Оценка аллельной изменчивости хряков различных линий в СГЦ «Западный» позволят сделать заключение, что оцененные производители являются чистопородными животными, т. к. различия между ними составляют 10 % (рис. 3).
Рис. 3. Структура аллельной изменчивости
Результаты оценки аллельной изменчивости племенных хряков, разводимых в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита», позволили выявить, что оцененные животные различных линий являются чистопородными, относящимися к белорусскому заводскому типу породы йоркшир, т. к. различия между линиями составляют 3 %. Наибольший удельный вес изменчивости приходится на индивидуальные особенности животных в линиях – 97 %, что характеризуется их генотипами.
В наших исследованиях по определению генетической принадлежности особей к линиям, или вероятность идентификации популяции, использован Assignment-тест. Данный тест показывает, насколько далеко находится друг от друга каждая особь в линии и как животные относятся к той или иной линии при условии независимого наследования локуса и генетического разнообразия. Результаты проведенного Assignment-теста свидетельствуют о консолидировании поголовья в линиях, разводимых в ОАО «СГЦ “Западный”» (рис. 4).
Рис. 4. Генетическая принадлежность хряков к линиям, разводимым в ОАО «СГЦ “Западный”», на основе использования Assignment-теста
Анализ, проведенный по девяти локусам МС-ДНК, показал высокую идентичность особей в популяции. Наиболее консолидированными были животные линии Друг 6805 и Дюшес 3962, т. к. они расположены в одной плоскости и на небольшом расстоянии друг от друга.
Наименьшие величины принадлежности хряков к имеющимся популяциям свиней различных линий белорусского заводского типа породы йоркшир, полученных на основании преобразования логарифмических вероятностей в положительные значения, указывают на более вероятную популяцию. Среди протестированных из СГЦ «Западный» хряков к линии Друг 6805 8 из 11 находятся в промежутке 7,589–8,773, в линиях Дюшес 3962 и Фактор 1573 – по 2 хряка в промежутках 4,396–4,697 и 2,181–2,783 соответственно.
Результаты проведенного Assignment-теста в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» характеризуют как две линии Друг 6805 и Добрый 2313 в белорусском заводском типе породы йоркшир и являются генетически высокодифференцированными (рис. 5).
Рис. 5. Генетическая принадлежность хряков к линиям, разводимым в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита», на основе Assignment-теста
При использовании Assignment-теста установлено, что в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» линейная принадлежность была подтверждена по одному хряку в линиях Добрый 2313 и Друг 6805, по двум хрякам в линии № 1131 – 7,981–8,680.
Животные линии Друг 6805 и Добрый 2313 находятся в одинаковой плоскости и на небольшом расстоянии от (10,525) до (14,913). На основании данного критерия можно предположить, что они имеют один корень происхождения, т. е. принадлежат к одной популяции.
Генетическое сходство между исследуемыми группами свиней в виде матрицы различных линий друг с другом в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир, разводимых в СГЦ «Западный», варьировало от 24,2 до 59,6 % и в среднем составило 38,2 % (табл. 4).
Наибольшее генетическое сходство было отмечено между линиями Дюшес 3962 и Друг 6805 (0,242), Фаянс 1672 и Друг 6805 (0,227). Таким образом, наибольшая удаленность исследуемых линий свиней отмечена между линиями Дюшес 3962 и Фактор 1573 (0,596), Фаянс 1672 и Фактор 1573 (0,479). Относительное близкое родство между различными линиями обусловлено, по-видимому, использованием в селекционных программах животных, происходящих от одного корня с разветвленной генеалогической структурой. Это свидетельствует о родстве йоркширов, разводимых в ОАО «СГЦ «Западный».
В качестве критерия оценки прикладной значимости генеалогических связей между различными линиями свиней использовали значения генетической дистанции. Анализ генетического расстояния показал небольшой размах изменчивости аллелофонда популяции белорусского заводского типа породы йоркшир в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита». Большие различия отмечены между новыми линиями Добрый 2313 и Друг 6805 (0,288), а меньшие – между Друг 6805 и № 1131 (0,247) (табл. 5).
Относительное близкое родство между линиями Друг 6805 и № 1131 (24,7 %) можно объяснить географической близостью животных двух популяций, большой вероятностью использования хряков сходного происхождения. Незначительное генетическое расстояние между линиями свиней белорусского заводского типа породы йоркшир из ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» указывает на формирование общего кластера по породному принципу и на общность предков внутри популяции.
Проведенные исследования привели к разработке дендрограммы филогенетического родства и происхождения свиней различной линейной принадлежности в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир, в основу которой положены генетические дистанции между исследуемыми группами свиней в виде матрицы генетического сходства различных линий друг с другом. Наибольшее генетическое сходство было отмечено между животными линий Дюшес 3962 и Друг 6805 из ОАО «СГЦ “Западный”». В ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» на основе анализа генетической структуры установлено родство линий Друг 6805 и Добрый 2313. Животные остальных линий по результатам исследований могут относиться к различному корню происхождения (рис. 6).
Рис. 6. Генеалогическая дендрограмма на основании генетических дистанций между различными линиями белорусского заводского типа породы йоркшир
Генеалогическое родство и общность происхождения отмечены между животными линий свиней Фактор 1573 и Фаянс 1672, что связано, по всей видимости, с единым направлением селекционно-племенной работы. Следует отметить, что животные, относящиеся к линии № 1131, входящие в белорусский заводской тип породы йоркшир, находятся на удаленном расстоянии, что видно из генеалогического дерева и образования отдельной ветви, что может указывать на различия в их происхождении с различиями направления селекции.
На основании проведенных исследований сформирована генеалогическая структура племенных стад в ОАО «СГЦ “Западный”» Брестской и ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» Минской областей, которая представлена двумя новыми линиями Добрый 2313 и Друг 6805. Разработана дендрограмма филогенетического родства на основе генетических дистанций между линиями, позволяющая подтвердить породную и линейную принадлежности существующих и новых линий в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир.
Заключение. Наши исследования продемонстрировали прикладную значимость проведенного эксперимента не только в контроле достоверности происхождения. Были сформированы следующие выводы:
1. Использование ДНК-микросателлитов дает четкую картину генетических различий как отражение исторического происхождения пород и характеристики многих важных популяционно-генетических параметров (уровень гетерозиготности, степень инбридинга, генетическая принадлежность к группе, линии, породе, наличие приватных аллелей структуры стад, оценка на отличимость, однородность, стабильность). На основе анализа аллельных профилей возможно сопоставление генетических и генеалогических результатов с выявлением особенностей у различных породных групп. Генетический анализ на основе ДНК–МС должен использоваться для характеристики генофонда свиней различных пород, восстановления исчезающих пород, на основе установления совпадения аллелей их размерного диапазона частот и наличия приватных аллелей, а также для оценки внутрипородной генеалогической структуры стад. Помимо этого, высокий уровень полиморфизма позволяет проводить научный поиск зависимости аллельных вариантов микросателлитных локусов с продуктивными признаками свиней.
2. В результате анализа генетического разнообразия в исследуемых линиях белорусского заводского типа свиней породы йоркшир установлено, что наблюдаемая степень гетерозиготности в линиях, разводимых в СГЦ «Западный» и ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита», находилась в пределах от 50,0 до 70,4 %. Животные линии Друг 6805 характеризовались максимальным значением ожидаемого гетерозиса (He=0,686±0,030), в то время как хряки, принадлежащие к линии Фактор 1573, имели минимальные значения показателя (He=0,333±0,088). Величины наблюдаемой гетерозиготности были выше на 1,80–37,1 %, чем ожидаемой, что указывает на высокий уровень «чистоты» генеалогической и генетической оригинальности линий исследованных животных в популяциях белорусского заводского типа свиней породы йоркшир. Выявлен достаточно высокий уровень наблюдаемой гетерозиготности, который подтвердился отрицательными значениями индекса фиксации (Fis) у животных различных линий, разводимых в СГЦ «Западный», но при этом у свиней из ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита» установлен небольшой дефицит гетерозигот, в частности в линиях Добрый 2313 и № 1131, что проявляется в положительных значениях индекса фиксации (Fis=0,125–0,198).
3. Изучено влияние линейной принадлежности и происхождения свиней на распределение частот встречаемости аллелей ДНК–МС. Установлено, что 4,0 % генетических различий обусловлено разнообразием в линиях, в то время как 3,2–3,7 % изменчивости приходится на индивидуальные особенности животных, т. е. внутрилинейное разнообразие.
4. При определении генетической принадлежности у хряков к линии с использованием Assignment-теста установлено, что из 19 протестированных хряков по четырем линиям свою линейность подтвердили 12 хряков. В «СГЦ “Западный”» породно-линейная принадлежность подтверждена у 8 из 11 протестированных хряков в линии Друг 6805, по два хряка в линиях Дюшес 3962 и Фактор 1573. Такая же тенденция отмечена в ГП «ЖодиноАгроПлемЭлита». Из протестированных 9 животных породно-линейную принадлежность подтвердили 4 хряка: по одному в линии Друг 6805 и Добрый 2313, два хряка-продолжателя в линии № 1131. Разработана дендрограмма филогенетического родства на основе генетических расстояний между линиями, позволяющая подтвердить породную и линейную принадлежности существующих и новых линий в белорусском заводском типе свиней породы йоркшир.
5. Таким образом, проведенные исследования, основанные на анализе микросаттелитов, показали, что животные различных линий в белорусском заводском типе породы йоркшир характеризуются высоким генетическим разнообразием, отличаются достаточной консолидированностью, что позволяет формировать племенные стада на основе массива представленных линий и уникальных особенностей аллелофонда популяции.