По всем вопросам звоните:

+7 495 274-22-22

УДК: 616–036.22 DOI:10.33920/med-08-2101-06

Диагностическая ценность метода LAMP с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени на модели герпес-вирусной инфекции

Смирнова Дарья Ильинична младший научный сотрудник, лаборатория молекулярной вирусологии, ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова; 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а; e-mail: daria.sm.1995@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-7325-0834
Грачева Анастасия Вячеславовна младший научный сотрудник, лаборатория молекулярной вирусологии, ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова; 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а; e-mail: nastuxa_70@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8428-4482
Волынская Елена Александровна научный сотрудник, лаборатория молекулярной вирусологии, ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова; 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а; e-mail: ev4240371@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7739-9337
Зверев Виталий Васильевич д-р биол. наук, профессор, академик РАН, научный руководитель, ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова; 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а; e-mail: vitalyzverev@outlook.com, https://orcid.org/0000-0001-5808-2246
Файзулоев Евгений Бахтиерович канд. биол. наук, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии, ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова; 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а; e-mail: faizuloev@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-7385-5083

В связи с широкой распространенностью и клинической значимостью герпес-вирусных заболеваний остается актуальным совершенствование методов их диагностики. Цель работы: совершенствование методических подходов к быстрой дифференциальной диагностике герпес-вирусных инфекций на основе метода LAMP с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (LAMP-РВ). Методом ПЦР-РВ и LAMP-РВ был исследован 201 урогенитальный соскоб, из которых 27 содержали ДНК вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), 34 — цитомегаловируса (ЦМВ), 14 — вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1), 36 — вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2). Для постановки LAMP-РВ использовалась ДНК-полимераза Bst 2.0 WarmStart (BioLabs, Великобритания), краситель SYTO-82 (Invitrogen, США), наборы праймеров для детекции ДНК герпес-вирусов в реакции LAMP. Показана высокая эффективность использования красителя SYTO-82 для обнаружения ДНК герпес-вирусов в реакции LAMP-РВ. В оптимальных условиях реакция LAMP-РВ позволяла в 3 раза сократить время проведения реакции по сравнению с ПЦР-РВ — до 25 мин. Диагностическая чувствительность реакции LAMP-РВ для ВПГ-1 составила 100 %, ВПГ-2 — 94,50 %, ВЭБ — 89 %, ЦМВ — 94 %. Диагностическая специфичность для всех исследованных вирусов составила 100 %. Аналитическая чувствительность выявления ВЭБ составила 104 копий ДНК/мл, ВПГ 1 и 2 типа и ЦМВ — 103 копий ДНК/мл. Таким образом, реакция LAMPРВ с красителем SYTO-82 позволяет быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять ДНК различных герпес-вирусов в клиническом материале и может рассматриваться как перспективный метод диагностики на месте лечения. Для широкого внедрения метода в практику лабораторной диагностики требуется решение проблемы создания внутреннего положительного контроля реакции и разработки портативных специализированных анализаторов.

Литература:

1. Kukhanova M. K., Korovina A. N., Kochetkov S. N. Human herpes simplex virus: life cycle and development of inhibitors. Biochemistry Mosc. 2014; 79 (13): 1635–1652.

2. Маркелова Е. В., Кныш С. В, Невежкина Т. А., Байбарина Е. В. Альфа-герпес-вирусы: современный взгляд на структуру (обзорная статья). Тихоокеанский медицинский журнал. 2018; 4 (74): 5–9.

3. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) (2020). URL: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/.

4. Мельникова С. Е., Троик Е. Б., Цитомегаловирусная инфекция и беременность (обзорная статья). Детская медицина Северо-Запада. 2012; 3 (3): 63–67.

5. Cole S. Herpes Simplex Virus: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Sexually Transmitted Infections. 2020; 55 (3): 283–456.

6. Иванова А. М., Имомалиева К. М., Наровлянский А. Н., с соавт. Глазные лекарственные пленки в лечении экспериментального герпетического кератоконъюнктивита. Вопросы вирусологии. 2019; 64 (5): 238–245.

7. Менделевич Е. Г., Менделевич С. В. Постгерпетическая невралгия: лечебно-профилактические аспекты и терапия прегабалином (обзорная статья). Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика. 2014; (2): 57–61.

8. Pillet S., Verhoeven P., Epercieux A., Bourlet T., Pozzetto В. Development and Validation of a LaboratoryDeveloped Multiplex Real-Time PCR Assay on the BD Max System for Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus DNA in Various Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology (medical journal). 2015; 53 (6): 1921–1926.

9. Суеркулов Э. С., Юлдашев И. М., Мамыралиев А. Б., Токтосунова С. А. Эффективность применения метода полимеразной цепной реакции для диагностики у детей с воспалительными заболеваниями слизистой оболочки полости рта. Бюллетень науки и практики. 2019; 5 (3): 1–6.

10. Миронова Л. В., Адельшин Р. В., Бикетов С. Ф., Щит И. А. с соавт. Петлевая изотермическая амплификация ДНК: принцип метода и перспективы применения в молекулярной диагностике холеры (обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (2): 120–124.

11. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., et al. Loop-mediated isothermal amplifi cation of DNA. Nucleic Acids Research (open-source scientifi c journal). 2000; 28 (12): 63–70.

12. Oscorbin I. P., Belousova E. A., et al. Comparison of fl uorescent intercalating dyes for quantitative loopmediated isothermal amplifi cation (qLAMP). BioTechniques (open-source scientifi c journal). 2016; 61 (1): 20–25.

13. Петруша О. А., Черниченко Т. Л., Кофиади И. А., Зверев В. В., Файзулоев Е. Б. Эффективность метода петлевой изотермической амплификации с флуоресцентной детекцией в диагностике парвовирусного энтерита у плотоядных. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 1: 90–95.

14. Namvar L., Olofsson S., Bergström T., Lindh M. Detection and typing of gB segment homologous for HSV types 1 and 2. Jornal of Clinical Microbiology (medical journal). 2005; 43 (5): 2058–2064.

15. Enomoto Y., Yoshikawa T., Ihira M., et al. Rapid Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infection by a LoopMediated Isothermal Amplification Method. Jornal of Clinical Microbioligy (medical journal). 2005; 43 (2): 951–955.

16. Nixon G., Garson J., Grant P., Nastouli E., et al. Comparative study of sensitivity, linearity, and resistance to inhibition of digital and non-digital polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplifi cation assays for quantifi cation of human cytomegalovirus. Analytical chemistry (American Chemical Society). 2014; 86 (9): 4387–4394.

17. Iwata S, Shibata Y, Kawada J. Rapid detection of Epstein — Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplifi cation method. Journal of Clinical Virology (International journal). 2006; 32 (2): 128–133.

18. Kaneko H., Iida T., Aoki K., Ohno Sh., Suzutani T., Sensitive and rapid detection of herpes simplex virus and varicella-zoster virus DNA by loop-mediated isothermal amplifi cation. Jornal of Clinical Microbioligy (medical journal). 2005; 43 (7): 3290–3296.

19. Смирнова Д. И., Петруша О. А., Грачева А. В., Волынская Е. А., Зверев В. В., Файзулоев Е. Б. Быстрая диагностика генитального герпеса методом петлевой изотермической амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 6: 40–46.

20. Петруша О. А., Файзулоев Е. Б. Методы детекции результатов реакции петлевой изотермической амплификации ДНК. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65 (1): 67–72.

1. Kukhanova M. K., Korovina A. N., Kochetkov S. N. Human herpes simplex virus: life cycle and development of inhibitors. Biochemistry Mosc. 2014; 79 (13): 1635–1652.

2. Markelova E. V., Knysh S. V., Nevezhkina T. A., Baibarina E. V. Alphaherpesviruses: the modern look at the viral structure. Tihookeanskij medicinskij zhurnal. 2018; 4: 5–9. (in Russian)

3. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) (2020). URL: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/.

4. Melnikova S. E., Troik E. B. Cytomegalovirus infection in pregnancy. Detskaja medicina Severo-Zapada. 2012; 3 (3): 63–67. (in Russian)

5. Cole S. Herpes Simplex Virus: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Sexually Transmitted Infections. 2020; 55 (3): 283–456.

6. Ivanova A. M., Imomalieva K. M., Narovlyansky A. N. et al. Ophthalmic drug fi lms in the therapy of experimental herpetic keratoconjunctivitis. Voprosy virusologii. 2019; 64 (5): 238–245. (in Russian)

7. Mendelevich E. G., Mendelevich S. V. Postherpetic neuralgia: Therapeutic and prophylactic aspects and pregabalin therapy. Nevrologija, nejropsihiatrija, psihosomatika. 2014; (2): 57–61. (in Russian)

8. Pillet S., Verhoeven P., Epercieux A., Bourlet T., Pozzetto В. Development and Validation of a LaboratoryDeveloped Multiplex Real-Time PCR Assay on the BD Max System for Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus DNA in Various Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology (medical journal). 2015; 53 (6): 1921–1926.

9. Suerkulov E., Yuldashev I., Mamyraliev A., Toktosunova S. The application eff ectiveness of the polymerase chain reaction method for the diagnosis of children with infl ammatory diseasesof the oral mucosa. Bjulleten’ nauki i praktiki. 2019; 5 (3): 1–6. (in Russian)

10. Mironova L. V., Adelshin R. V., Biketov S. F., Shchit I. A., et al. The loop isothermal amplifi cation ofDNA: principle of method and perspectives of application in molecular diagnostics of cholera: publications review. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2017; 62 (2): 120–124. (in Russian)

11. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., et al. Loop-mediated isothermal amplifi cation of DNA. Nucleic Acids Research (open-source scientifi c journal). 2000; 28 (12): 63–70.

12. Oscorbin I. P., Belousova E. A., et al. Comparison of fl uorescent intercalating dyes for quantitative loopmediated isothermal amplifi cation (qLAMP). Bio Techniques (open-source scientifi c journal). 2016; 61 (1): 20–25.

13. Petrusha O. A., Chernichenko T. L., Kofi adi I. A., Zverev V. V., Faizuloev E. B. Eff ectiveness of the method of loop isothermal amplifi cation with fl uorescence detection in the diagnosis of parvovirus enteritis in carnivores. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 2019; 1: 90–95. (in Russian)

14. Namvar L., Olofsson S., Bergström T., Lindh M. Detection and typing of gB segment homologous for HSV types 1 and 2. Jornal of Clinical Microbiology (medical journal). 2005; 43 (5): 2058–2064.

15. Enomoto Y., Yoshikawa T., Ihira M., et al. Rapid Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infection by a LoopMediated Isothermal Amplification Method. Jornal of Clinical Microbioligy (medical journal). 2005; 43 (2): 951–955.

16. Nixon G., Garson J., Grant P., Nastouli E., et al. Comparative study of sensitivity, linearity, and resistance to inhibition of digital and non-digital polymerase chain reaction and loop mediated isothermal amplifi cation assays for quantifi cation of human cytomegalovirus. Analytical chemistry (American Chemical Society). 2014; 86 (9): 4387–4394.

17. Iwata S, Shibata Y, Kawada J. Rapid detection of Epstein — Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplifi cation method. Journal of Clinical Virology (International journal). 2006; 32 (2): 128–133.

18. Kaneko, H., Iida, T., Aoki, K., Ohno, Sh., Suzutani, T., Sensitive and rapid detection of herpes simplex virus and varicella-zoster virus DNA by loop-mediated isothermal amplifi cation. Jornal of Clinical Microbioligy (medical journal). 2005; 43 (7): 3290–3296.

19. Smirnova D. I., Petrusha О. А., Gracheva A. V., Volynskaya Е. А., Zverev V. V., Faizuloev E. B. Rapid diagnostics of genital herpes by loop-mediated isothermal amplifi cation method with fl uorescent detection. Zhurnal mikrobiologii, jepidemiologii i immunobiologii. 2019; (6): 40–46. (in Russian)

20. Petrusha O. A., Faizuloev E. B. Detection methods for results of a loop-mediated isothermal amplifi cation of DNA. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2020; 65 (1): 67–72. (in Russian)

Вирусы семейства Herpesviridae составляют обширную группу ДНК-содержащих вирусов, широко распространенных в человеческой популяции [1]. На сегодняшний день известно 9 видов герпес-вирусов, патогенных для человека [2]. Подсемейство Alphaherpesvirinae включает виды Human alphaherpesvirus 1 (вирус простого герпеса 1 типа, ВПГ-1), Human alphaherpesvirus 2 (вирус простого герпеса 2 типа, ВПГ-2) и Human alphaherpesvirus 3 (вирус Varicella Zoster; ВЗВ). К подсемейству Betaherpesvirinae относят Human betaherpesviris 5 (цитомегаловирус; ЦМВ), а также Human betaherpesviris 6А и 6В (вирусы герпеса 6 типа A и В, ВГЧ-6А, ВГЧ-6B) и Human betaherpesviris 7 (вирус герпеса 7 типа, ВГЧ-7). Подсемейство Gammaherpesvirinae включает виды Human gammaherpesvirus 4 (вирус Эпштейна-Барр, ВЭБ) и Human gammaherpesvirus 8 (вирус герпеса человека 8 типа, ассоциированный с саркомой Капоши, ВГЧ-8) [3].

Герпес-вирусная инфекция способна протекать как в бессимптомной форме, так и сопровождаться заболеваниями различной степени тяжести [1, 2]. Герпес-вирусы могут быть причиной тяжелой патологии при заражении новорожденных, людей с ослабленным иммунитетом, беременных женщин и плода. Врожденная ЦМВ-инфекция может вызвать выкидыш, мертворождение или смерть после родов [4]. Помимо этого, ЦМВ-инфекция является частой причиной смерти у людей с ослабленным иммунитетом. Вирус латентно персистирует в организме и при реактивации способен поражать многие внутренние органы, в том числе ЖКТ, легкие, печень и ЦНС. Рецидивирующие инфекции, вызванные вирусами простого герпеса, характеризуются наличием неприятных, часто болезненных высыпаний на губах, коже, гениталиях или глазах. Осложненное течение ВПГ-инфекции часто приводит к таким тяжелым состояниям, как герпетический кератит, менингит, энцефалит, неонатальный герпес, а также диссеминированная инфекция у людей с ослабленным иммунитетом [5, 6]. Герпетические нейроинфекции (летальный исход в 20 % случаев, инвалидизация — 50 % случаев) [7] и офтальмогерпес (в 50 % случаев приводит к развитию катаракты или глаукомы) приводят к наиболее опасным для здоровья последствиям. Некоторые представители герпес-вирусов, например ВЭБ, ВГЧ-8, могут также стать причиной развития злокачественных новообразований (лимфома Беркитта, B-клеточная лимфома, саркома Капоши и др.).

Для Цитирования:
Смирнова Дарья Ильинична, Грачева Анастасия Вячеславовна, Волынская Елена Александровна, Зверев Виталий Васильевич, Файзулоев Евгений Бахтиерович, Диагностическая ценность метода LAMP с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени на модели герпес-вирусной инфекции. Санитарный врач. 2021;1.
Полная версия статьи доступна подписчикам журнала
Язык статьи:
Действия с выбранными: