Доклинические и клинические исследования (ДКИ и КИ) являются необходимой частью процесса регистрации лекарственных препаратов. Исследования токсикокинетики в ДКИ и фармакокинетики во всех фазах КИ требуют надежных методов измерения концентрации действующего вещества в сложных матрицах (плазма и сыворотка крови, другие биологические жидкости). Нормативные документы устанавливают подробные и достаточно строгие требования к биоаналитическим методикам [1–7], поэтому не каждый метод, успешно использующийся в научных целях, может быть надлежащим образом валидирован и использован в исследованиях, проводимых в соответствии со стандартами GLP и GCLP. В частности, стандарты индустрии более строго трактуют понятие «чувствительность» (sensitivity) метода, определяя его как нижний предел количественного определения (НПКО), — количество аналита, которое может быть измерено с достаточной правильностью и прецизионностью, а не как предел обнаружения — количество аналита, сигнал от которого можно надежно отличить от фона [1, 2].
Для определения низкомолекулярных соединений в биологических образцах чаще всего используются методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ВЭЖХ-масс-спектрометрии. В случае же если действующее вещество является биологическим препаратом (чаще всего белковой природы), обычно используются методы связывания лиганда (ligand binding assays), в первую очередь иммуноферментный анализ (ИФА) [8]. Альтернативами ИФА для определения концентрации макромолекул служат радиоиммунный анализ (RIA), иммунофлуоресцентый анализ (IFA), поверхностный плазмонный резонанс, биослойная интерферометрия, жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией и ряд других методов [8–10].
Одной из интересных альтернатив ИФА для биоаналитических исследований является хемилюминесцентный метод связывания лиганда AlphaLISA [11], отличающийся большей производительностью и чувствительностью.
AlphaScreen и AlphaLISA [11, 12] — методы связывания лиганда, в отличие от ИФА не требующие стадии отмывки (гомогенные), более быстрые и менее трудозатратные. В основе Alpha (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) технологий лежит оригинальный хемилюминесцентный метод генерации сигнала за счет передачи энергии между двумя частицами («бидсами») из полистирола размером 250–350 нм (рис. 1). Антитела (или другие лиганд-связывающие агенты) иммобилизуются на частицы двух типов — донорные и акцепторные. Донорные частицы содержат фталоцианин и при возбуждении светом с длиной волны 680 нм выделяют синглетный кислород, который существует в этой форме около 4 миллисекунд и распространяется на небольшое (около 200 нм) расстояние. Если в растворе присутствует аналит, за счет его взаимодействия с антителами на донорных и акцепторных частицах образуется «сэндвич», «бидсы» сближаются, и синглетный кислород достигает акцепторной частицы. Акцепторные частицы AlphaScreen содержат три красителя — тиоксен, антрацен и рубрен. Тиоксен реагирует с синглетным кислородом, испуская энергию, которая затем передается по каскаду через антрацен к рубрену. Излучение рубрена (520–620 нм) фиксируется фотометром. В методе AlphaLISA акцепторные частицы содержат европий вместо антрацена и рубрена и излучают более узкий и интенсивный спектр с максимумом в 615 нм. Метод оптимизирован для использования в сложных биологических смесях, сдвиг спектра и его сужение необходимо, чтобы снизить влияние гемоглобина и других окрашенных веществ крови.