Bacillus megaterium: amino acid producer and probiotic for farm animals (review)

Актуальность темы

В современном животноводстве и кормлении животных практическая микробиология занимает значимую позицию. Различные направления микробиологического синтеза активно применяются в индустрии кормов и кормовых добавок. Так, например, уже более 50 лет промышленное производство аминокислот осуществляется при помощи биотехнологий, ежегодные темпы роста производства составляют 5‒7 %. В процессе микробиологического синтеза аминокислоты получают в ходе ферментации с использованием высокоэффективных штаммов различных видов бактерий, например Escherichia coli, как правило, на углеводных питательных средах из сахаров (патока, сахароза или глюкоза) [12]. Развитие рынка было особенно динамичным для лимитирующих кормовых аминокислот, которые добавляют в комбикорма сельскохозяйственных животных и птицы: метионин, лизин, треонин, триптофан, валин и др. По мере прогрессивного развития микробиологических технологий и изучения состава микрофлоры животных происходит открытие новых видов микроорганизмов-продуцентов полезных веществ. В их числе Corynebacterium glutamicum, Bacillus megaterium и др., на основе которых создаются кормовые добавки и пробиотики.

B. megaterium в животноводстве

B. megaterium – палочковидные, грамположительные аэробные мезофильные спорообразующие бактерии рода Bacillus с широким ареалом обитания, галофильные. Открытие бактерии принадлежит Антону де Бари (1884 г.). Бактерия была названа megaterium (в пер. с греческого значит «большое животное») в связи со своим большим размером примерно в 100 раз больше, чем E. Coli длина палочек B. megaterium до 4 мкм, диаметр – до 1,5 мкм. Величина генома B. megaterium – 5,8 мегабаз, содержание Г+Ц (37,5 %), оптимум температуры – 30‒37°С.

В. megaterium вместе с некоторыми другими видами рода Bacillus, в т. ч. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus brevis и Bacillus clausii образуют очень ценную с индустриальной точки зрения группу микроорганизмов. Они обладают высокоэффективной системой синтеза и транспорта белков из клетки, растут на различных доступных и недорогих углеродных субстратах (не строго специфичны к субстрату).

B. megaterium относятся к бактериям-полипродуцентам, т. к. их клетки способны нарабатывать множество веществ различной химической природы. Многие из них могут быть полезны, в т. ч. для многоклеточных живых организмов, включая сельскохозяйственных животных и человека. B. megaterium способны нарабатывать как сложные биомолекулы (пептиды, энзимы и др.), так и простые вещества, такие как бутират, аспартат и глутамат. Важно также, что B. Megaterium – непатогенны в отношении растений, животных и человека и не вырабатывают в среду щелочные протеазы.

Геном B. megaterium сохраняет стабильность в присутствии векторных конструкций. Сами микроорганизмы B. megaterium стабильны в широком диапазоне рН и при воздействии высоких температур и таким образом стабильно сохраняют свои свойства в ходе производственных циклов, а также при хранении и транспортировке получаемых продуктов. В сочетании с их непатогенностью и безопасностью для животных и человека это делает их подходящим объектом для создания на их основе пробиотиков и кормовых добавок, наряду с другими представителями рода Bacillus, такими как B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. coagulans и B. megaterium [14, 17].

B. megaterium выделяют из почвы и промышленных ферментеров. B. megaterium – функциональный модельный организм: создание рекомбинантных штаммов и направленная селекция B. megaterium перспективна для науки и биотехнологий, медицины, пищевой промышленности и сельского хозяйства (растениеводство и животноводство) [9, 20]. Метаболизм, биохимия и генетическая структура этой бактерии подробно описаны, что позволяет вести направленную работу с микроорганизмом с применением методов селекции, клонирования и генной инженерии и других наиболее современных технологий. При помощи такой направленной селекции возможно создавать новые штаммы бактерии с повышенной активностью и/или количеством продукции требуемых веществ. С применением транскриптома, протеома и метаболома бактерии при помощи методов биоинформатики проводятся исследования биосистем и построение биомоделей. В общей сложности уже создано более 100 генетически охарактеризованных штаммов B. megaterium, а также векторов и плазмид для клонирования, около 10 стандартных плазмид полностью отсеквенированы [18, 19].

Вещества, которые вырабатывает B. megaterium, различны по своей химической природе и свойствам – это протеазы, антибиотики, пептиды, витамины, бактериоцины и ряд других соединений. В связи с этим, B. megaterium проявляет различные виды активности, в т. ч.:

1) антимикробную, антибиотикподобную (вырабатывает различные виды бактериоцинов: липопептиды-сурфактины и лихеницины, итурин и фунгицины);

2) протеолитическую (продуцент протеаз – их в геноме насчитывается около 30 генов различных протеаз, в т. ч. несколько видов амилаз);

3) фунгицидную;

4) продуцент витамина B12 (цианкобаламина);

5) продуцент аминокислот;

6) пробиотик.

Помимо перечисленных видов активности, B. megaterium является продуцентом сурфактантов и фермента пенициллин-ацилазы, который применяется в синтезе бета-лактамных антибиотиков, в т. ч. синтетического пенициллина [10].

Таким образом, из B. megaterium можно получать большое количество разнообразных целевых субстанций от плазмид и векторов до витаминов и биодобавок, причем не только качественно, но и количественно: штаммы B. megaterium в культуре обеспечивают хороший выход продуктов, при этом затраты на выращивание и культивацию этой бактерии сравнительно невысоки. Такие характеристики делают данный микроорганизм привлекательным как функционально, так и с точки зрения экономической рентабельности. B. megaterium обладает развитой системой транспорта и секреции метаболитов и нарабатывает их непосредственно в среду [18, 19].

Еще в 1982 г. в работах C. A. Loshon, P. Setlow [13] была выделена и охарактеризована высокоактивная протеаза из B. megaterium. В литературе также описано несколько видов различных амилаз B. megaterium [8]. В общей сложности в геноме B. megaterium содержится информация о более чем 30 различных протеазах, включая металлопротеазы, амилазы, аминопептидазы, нейтральные протеазы [9].

Протеолитические ферменты, получаемые из B. megaterium, производятся в виде отдельных коммерческих препаратов, в т. ч. ведущими мировыми компаниями, такими как Merck, Megazyme и др. В их числе амилаза, глюкозодегидрогеназа, глицеролдегидрогеназа, фосфотрансацетилаза.

Направленный микробиологический синтез аминокислот

Аминокислоты – основные строительные блоки всех структурных и функциональных белковых молекул организма, вещества, жизненно необходимы каждому живому организму [2, 6]. Большинство микроорганизмов, таких как кишечная палочка, могут синтезировать все 20 основных аминокислот, в то время как организм животных и человека способен вырабатывать только 9 из 20 аминокислот. Остальные аминокислоты животные должны получать в составе корма регулярного рациона, т.к. они жизненно необходимы для строения организма и протекания всех жизненных процессов – это незаменимые аминокислоты [1, 3]. Уровень протеинового питания у животных и птицы контролируют по содержанию незаменимых аминокислот. Заменимые аминокислоты – это те аминокислоты, которые могут синтезироваться в организме животного de novo. Дефицит хотя бы одной аминокислоты приводит к отрицательному балансу азота. В этом состоянии больше белка разлагается, чем синтезируется, и, таким образом, выделяется больше азота, чем поступает в организм.

Биохимические пути синтеза незаменимых аминокислот более сложны и могут включать от 5 до 16 шагов [2, 4, 6]. Заменимые аминокислоты синтезируются de novo в ходе довольно простых реакций. Так, например, заменимые аминокислоты аланин и аспартат могут быть синтезированы в одну стадию из пирувата и оксалоацетата соответственно. Исключением является заменимая аминокислота аргинин – ее синтез de novo включает 10 реакций. Обычно, однако, бывают необходимы всего 3 реакции преобразования орнитина (часть цикла мочевины). Для синтеза другой заменимой аминокислоты (тирозина) необходима всего лишь 1 стадия при синтезе из фенилаланина и 10 стадий при синтезе с нуля.

Зачастую базовый рацион не содержит всех аминокислот в достаточном для оптимального роста и продуктивности животного количестве. С этой целью в рацион вводят различные виды дополнительных источников аминокислот, чтобы компенсировать их дефицит [1, 3, 5]. Выращивание бактериальных продуцентов на специфических питательных средах позволяет получать штаммы, направленно продуцирующие те или иные аминокислоты в большем количестве. К ним относятся аспартат и глутамат-продуцирующие штаммы. К наиболее распространенным продуцентам относятся B. subtilis, Corinebacterium glutamicum. Разрабатываются также новые штаммы других видов, в том числе бактерии-полипродуценты B. megaterium.

Кормовые пробиотики на основе B. megaterium

Ввиду снижения рекомендуемых количеств добавления антибиотиков в комбикорма при выращивании сельскохозяйственных животных и птицы значение пробиотиков и пребиотиков для практического животноводства возрастает, т. к. они совмещают в себе функции биологически активной и полезной для микрофлоры, пищеварения и продуктивности добавки и эффективной против патогенов бактерицидной субстанции.

В прикладной микробиологии для животноводства на основе штаммов микроорганизмов создаются пробиотики и пребиотики для сельскохозяйственных животных. Пробиотики – это микробиотические добавки, которые улучшают состояние кишечной микрофлоры организма животного [7]. Пребиотики – это вид натуральных кормовых добавок на основе полезных видов микроорганизмов, которые стимулируют нативную микрофлору организма-хозяина и/или усиливают эффект действия пробиотиков [16].

B. magaterium является нативным хабитатом кишечной микрофлоры животных и птицы и наработка полезных метаболитов, в т. ч. аминокислот, происходит непосредственно в среде организма-хозяина. Для того чтобы подтвердить безопасность штамма-продуцента, а также отсутствие у него вирулентности и генов резистентности к антибиотикам, необходимо создание подробной генетической карты/характеристики этого штамма. Целевое вещество должно сохранять стабильность внутри пищеварительного тракта организма-хозяина, в т. ч. в присутствии других субстанций (вакцины, антибиотики). Следует также принимать во внимание, что ЖКТ – это сложная мультисоставная среда, в которой присутствует большое число микроорганизмов, и они могут оказывать влияние друг на друга, в т. ч. и на микроорганизм-пробиотик и вещества, которые он продуцирует. Реакция может быть различной, в зависимости от вида животных. С другой стороны, бактерии-патогены, в т. ч. возбудитель некротического энтерита C. perfringens, обладают высокой адаптивностью. Из-за этого может развиваться резистентность как к антибиотикам, так и к компонентам пробиотиков и кормовых добавок [7].

Так, например, пробиотики для борьбы с некротическим энтеритом бройлеров создаются на основе различных видов микроорганизмов, в основном из родов Bacillus, Enterococci, Bifidobacteria, Lactobacilli (по нескольку видов из каждого таксона, продолжают открывать новые виды). Для таких пробиотиков, в т. ч. в сочетании с пребиотиками, уже доказана их эффективность против некротического энтерита, сравнимая с эффектом традиционных антибиотиков, например бацитрацина. Применение B. megaterium в качестве пробиотика – сравнительно новое решение в микробиологии для животноводства. Литературные данные опубликованы по применению бактерии в качестве пробиотика для рыб сомов [15]. Поскольку B. megaterium принадлежит к роду Bacilli, имеет большую гомологию с B. subtilis, можно предположить, что этот микроорганизм тоже будет эффективен для бройлеров как в виде монопробиотика, так и в составе комплексных биодобавок, содержащих два и более видов микроорганизмов. В эспериментальной работе 2015 г. на крысах была показана эффективность применения пробиотика из B. megaterium. Действие этого пробиотика подобно более известным пробиотикам на основе лактобактерий [11].

Экономика эффективность B. Megaterium

При разработке кормовых добавок, особенно в случае мелких животных и птицы, которые сами по себе имеют низкую рыночную себестоимость, цена продукта имеет ключевое значение.

B. megaterium относится к сапрофитам – микроорганизмам, которые способны питаться за счет разлагающегося/мертвого вещества и различных отходов. Культуры B. Megaterium, как правило, хорошо растут в ферментерах на продуктах вторичной переработки и даже отходах других сельскохозяйственных и пищевых производств. В разных странах для выращивания бактерии используются следующие виды субстратов:

– глюкозный сироп, свекловичный жом (Египет, Саудовская Аравия, Германия);

– глицерол или глюкоза (Колумбия);

– отходы молочного производства (Индия, Таиланд);

– сырое масло и жмых из арахисового масла (Индия);

– маниока (Бразилия);

– тростниковый жом (molasses), кукурузный сироп, почвенные источники углерода и азота (Таиланд).

Существуют также стандартные коммерческие среды для выращивания B. megaterium.

Таким образом, затраты на выращивание B. megaterium относительно невысоки и производство продуктов на ее основе экономически рентабельно, т. к.:

1) для выращивания бактерии подходит недорогое сырье;

2) синтез происходит с высоким выходом продукта;

3) разнообразие получаемых субстанций;

4) поддержание стратегии «безотходного производства» (recycling, environment-friendly) и охраны окружающей среды от загрязнения различными промышленными отходами – выращивание бактерии позволяет не только получать необходимые вещества, но и с пользой перерабатывать при этом ряд производственных отходов.

Выводы

1. B. megaterium по праву можно назвать «большая бактерия-фабрика» не только из-за большого размера самой бактерии, но и из-за огромного количества разнообразных веществ, которые она производит (в данном обзоре приведены лишь часть из них, это далеко не полный список).

2. Микроорганизм B. megaterium применим, в т. ч. для птицеводства как высокоэффективная полифункциональная биодобавка как сам по себе, так и в составе премиксов, пробиотиков, пребиотиков и других комплексных препаратов.

3. Ожидаемые эффекты применения B. megaterium в составе премиксов для бройлеров в спектре включают в себя:

– протеолитический (способствует повышению усвояемости корма и улучшению конверсии и ростовых показателей поголовья);

– источник витамина В₁₂;

– противоэнтеритный (вырабатывает бутират, сурфактин, итурин);

– фунгицидный;

– источник ценных аминокислот;

– натуральный микробиологический пробиотик.

4. Высокая продуктивность бактерии, широкий спектр нарабатываемых веществ, нетрудоемкое выращивание на дешевых доступных субстратах и общая низкая затратность производства при высоком производственном выходе – все это делает «большую бактерию-фабрику» B. megaterium функциональным, перспективным объектом в микробиологическом производстве для сельского хозяйства, в т. ч. практического животноводства и комбикормовой промышленности, т. к. ее применение может улучшить качество производимых продуктов и повысить экономическую рентабельность производства. Перспективные продукты микробиологического синтеза на основе бактерии – это пробиотики на основе B. megaterium, а также штаммы с повышенным синтезом лимитирующих аминокислот.